胰腺癌患者新辅助化疗过程中免疫功能随访观察——个案浅析
唐古生 1 ，金钢 2
1，上海长海医院血液内科；2，上海长海医院肝胆胰脾外科

病史简介：肖某，男，60 岁，因「腰背部疼痛 2 月余」就诊，查外周血 CA199>1200U/ml，胰腺增强动脉造影示胰腺癌。2019.5.24 日超声内镜引导下的细针穿刺（EUS-FNA）诊断胰腺癌。既往高血压病史，控制良好，无心脑血管病史，无糖尿病史，10 年前因胆囊结石伴慢性胆囊炎行腹腔镜下胆囊切除术。10 年前因甲状腺瘤行腔镜下甲状腺瘤切除术。吸烟 20 年×20 支，未戒烟，少量饮酒。入组新辅助化疗后手术组。

主要诊断：胰腺癌，高血压

临床治疗：2019.6.4 起行 S1（替吉奥）+白蛋白紫杉醇化疗 8 个周期，2019.9.6 开始射波刀 6 次放疗，合计照射剂量 40.8 Gy。2019.9.24 全麻下行开腹胰体癌根治手术、左肾上腺切除术和腹膜后淋巴结清扫术，术后病理诊断胰腺导管癌。

辅助检查： 

1、胰腺磁共振增强：

2、肿瘤标志物检测：在患者化疗前、化疗及射波刀治疗后及外科手术前 1 天、手术后三月余进行肿瘤标志物检测。

3、免疫功能参数检测：

患者启动化疗初期、放化疗完成后手术前 1 天和手术 1 天后，采用十三色流式细胞仪（DxFlex, Beckman coulter）进行了三次免疫评估，观察放化疗前后，患者系统免疫参数的可能变化及其与临床其他肿瘤参数的关系。涉及的免疫功能评估参数检测指标如下：
（1）CD3/CD4/CD8/CD19/CD16/CD56/CD69/HLA-DR/CD14/CD11c/CD45。聚焦各种免疫细胞亚群的比例变化和活化状态，CD4/CD8 的比值、T 细胞亚群 CD69，HLA-DR 的表达情况；单核细胞亚群 Lin(CD3,CD19,CD56)-CD14 hiCD16- Classic Mono，Lin(CD3,CD19,CD56)-CD16 highCD14low nonclassic Mono，Lin(CD3,CD19,CD56)-CD14 hiCD16+ Intermediate Mono， Lin(CD3,CD19,CD56)- CD14- HLA-DR+ CD11c+ mDC 占外周血单个核细胞的比例；
（2）CD3/CD4/CD8/CD45RA/CD45RO/CD27/HLA-DR/CCR7/CD25/CD127。聚焦 T 细胞中 Th, CTL 中 Naïve T（CD27+ CD45RA+ CD45RO-）、Central memory T（CD27+ CD45RA- CD45RO+）、Effector memory T（CD27- CD45RA- CD45RO+）、Effector memory CD45RA+ T（CD27- CD45RA+ CD45RO+）以及 Treg（CD4+CD8-CD25 hiCD127-）各细胞亚群占相应 T 细胞群体的比例；
（3）CD3/CD4/CD8/CD28/4-1BB/PD-1/CTLA4/TIM-3/Lag3/CD38。聚焦于 Th（CD3+CD4+CD8-）and CTL（CD3+CD4-CD8+）T 细胞检查点共刺激分子 CD28、4-1BB、CD38、PD-1、CTLA4、TIM3、Lag3 等分子阳性细胞占相应 T 细胞的比例。

免疫参数检测结果：

本例患者诊断初期先进行新辅助化疗，完成化疗周期及射波刀治疗之后，血清肿瘤标志物均降至正常，MRI 提示肿瘤显著缩小，提示放化疗对患者治疗效果显著。我们在化疗之初、放化疗疗完成手术治疗前 1 天、术后 1 天，取患者临床检测 EDTA 抗凝标本，进行免疫功能参数评估，拟观察新辅助化疗前后患者免疫功能改变情况，初步了解治疗前后患者系统性免疫功能改变与临床疗效的可能相关性。由于涉及可分析免疫参数较多，我们仅罗列了部分关键参数和变化较大的数据，加以初步观察。尽管术后 1 天免疫参数分析可能受到手术本身及相关治疗措施的影响，但术前术后数据同时罗列比对，可以增加辅助化疗前后免疫参数变化的确定性，因而在下图中一并列出。

差异较大的结果包括：

（1）治疗好转后，患者淋巴细胞比例显著下调，粒细胞显著回升，单核细胞比例显著增加。
（2）治疗好转后 NK 细胞中 CD16+CD56-比例显著上升，CD16+CD56dim 较为明显下降。
（3）治疗好转后，B 细胞占淋巴细胞比例、mDC 细胞比例显著下调。
（4）治疗好转后，中枢记忆 CD4+T 占 CD4+T 细胞比例呈现较为明显的下调趋势，效应记忆 CD4+T 和 CD8+T 细胞比例呈现较为明显的上升趋势。
（5）治疗好转后，部分 T 细胞表面活化标志 HLA-DR 和 CD38 在 CD3+T 细胞以及 CD4+和 CD8+T 细胞均显著增高。
（6）治疗好转后，CD4+和 CD8+T 细胞表面免疫抑制分子 PD-1、CTLA-4、Tim-3 均呈显著下调。
（7）治疗好转后，Lin(CD3,CD19,CD56)-CD16 highCD14low nonclassic 单核细胞显著下调。
（8）治疗好转后，CD4/CD8 比例、Treg 细胞占 T 细胞比例、NK 细胞占淋巴细胞比例等改变均不明显。

讨论：

胰腺癌，尤其是导管腺癌，是恶性程度最高的肿瘤之一，5 年生存率仅 9%。提高胰腺癌的诊疗水平，改善胰腺癌的预后是急需解决的重要临床问题。吉西他滨联合白蛋白紫杉醇等化疗方案是局部进展期、不可切除和转移性胰腺癌的一线标准治疗。临床研究显示其相对于单药吉西他滨可以显著提高总反应率，延长总生存 2-5 个月。现有的数据表明，PD-1/CTLA-4 抑制剂可通过阻断肿瘤对 T 细胞的抑制，在肿瘤中表现出显著肿瘤杀伤作用，已在黑色素瘤等多种肿瘤中获批治疗适应症，或开展多中心临床研究。在胰腺癌研究中也有多个初步临床数据证实 PD-1 与新辅助化疗联合应用显著延长患者无进展生存和总生存的报道。这表明免疫系统改变在胰腺癌肿瘤发生发展以及临床治疗疗效中充当了非常重要的角色，改善患者的免疫功能状态，可能有助于胰腺癌患者的治疗疗效。对患者治疗过程免疫功能的检测可能有助于了解患者的免疫功能改变、预测临床治疗效果、评价靶向治疗靶位表达等作用。

既往研究表明胰腺癌肿瘤微环境中，炎性浸润细胞可能多处于免疫抑制状态，抑制性的免疫细胞、高表达的免疫抑制分子、免疫抑制性炎性因子局部浓度增加都可能参与了局部的免疫抑制微环境的形成，这些免疫抑制状态在肿瘤患者外周血细胞因子、免疫细胞组成以及免疫细胞表面关键功能分子（系统性免疫）上可能会有明显的体现。由于系统性免疫参数的多样性和复杂性，肿瘤患者系统性免疫在肿瘤中的作用相对缺乏大样本确定性的研究结论。目前对于胰腺癌放化疗有效患者治疗前后，患者系统性免疫功能改变及其与临床肿瘤参数相关性尚无确定的研究结论。

本例患者检测结果提示，新辅助化疗和放疗有效，肿瘤明显缩小，肿瘤标志物多降至正常。与此同时，患者系统免疫功能参数发生了明显的改变：患者外周血白细胞构成比例逐步恢复正常；与免疫杀伤功能密切相关的 T 细胞比例、T 细胞的活化分子如 HLA-DR 和 CD38 显著增加；而免疫抑制功能相关的分子如 PD-1、CTLA-4、Tim-3 显著下调，提示 T 细胞处于持续活化的功能状态；同时，中枢记忆 CD4+T 明显的下调、效应记忆 CD4+和 C8+T 明显上升，提示患者体内 T 细胞处于更剧烈的分裂增殖和更强的肿瘤杀伤功能状态。表明临床疗效好转的过程中，患者免疫平衡发生了改变，向有利于肿瘤控制的方向转变。另外，部分检查点指标如 PD-1、CTLA-4 等是目前临床在用免疫治疗的重要靶位，本例患者放化疗呈现较好治疗疗效的同时，T 细胞表面 PD-1、CTLA-4 显著下调，处于极低的表达水平。因此，临床如拟同时做 PD-1 和 CTLA-4 抑制剂治疗，可能需要合适的用药时机，并且应检测相关靶位在 T 细胞或肿瘤细胞表面表达情况，以更好的挑选可能治疗有效的患者，减少不必要的治疗毒性作用。其他文献中关注的部分敏感指标如 CD4/CD8 比值、Treg 细胞占 T 细胞比例、NK 细胞占淋巴细胞比例等本例患者均无明显改变，提示在不同肿瘤中免疫细胞与肿瘤之间的作用可能并不完全相同，仅已来院传统简单的免疫功能评估对临床的参考和指导价值有限。当然本文的数据仅为治疗有效的单个患者系统免疫参数的初步观察，尚不具备代表性的一致性差异，仍需要在包括放化疗无效患者的大规模临床研究中进一步观察。某些差异较大、临床关注较少的细胞，如 CD16+CD56-NK 细胞、CD16 highCD14low nonclassic 单核细胞、mDC 细胞比例、B 细胞占淋巴细胞比例，既往研究均认为具有相应的特殊免疫功能作用，其是否在胰腺癌肿瘤发生发展中扮演了角色或可作为疗效评估的参考依据，也需要临床的进一步重视和探讨。

总之，本研究初步了解了单例临床治疗有效的胰腺肿瘤患者，在治疗前后各种细胞亚群、关键分子的表达水平及其特点。本例放化疗临床评估有效的患者，其肿瘤消退过程中伴随着显著的免疫功能参数改变，这些免疫功能参数改变大致符合既往研究对肿瘤免疫平衡改变的认识。这些免疫参数改变是否具有胰腺肿瘤疗效相关的特异性、是否反映免疫系统参与了放化疗取得临床疗效的过程或者仅仅是放化疗有效的伴随变化，仍需要进一步数据积累和文献挖掘。进一步大规模的临床研究可以全面评价系统性免疫功能对胰腺癌患者疗效监测、预后评估和药物靶标检测指导治疗的临床应用价值。本案例也提示多参数流式检测能够同时评估更多的细胞种类和更多的细胞亚群及其表面的关键分子，是肿瘤免疫功能全面的评估和检测的重要和关键手段。过程中我们也认识到，多色流式应用会产生大量免疫细胞亚群及功能分子的数据，相互关系复杂，临床可变因素较多，解释困难，对人员专业理论技能要求极高。高通量的自动分析筛选和通路拟合辅助临床结果解释，可能是未来流式检测努力的方向之一。系统免疫参数的临床结果解释还需要考虑患者年龄、性别、吸烟和巨细胞病毒感染对免疫功能的影响，单次检测结果可能会产生解释偏差，动态随访可能是较好的临床监测模式。

作者简介：

唐古生，男，医学博士，副主任医师、副教授，硕士生导师；上海长海医院血液内科主任助理，血液病临床实验室主任；主持国家自然基金等 7 项课题，以第一或通讯发表 SCI  论文 17 篇，核心 30 余篇，曾获上海市优秀博士论文、上海市科学技术一等奖、个人三等功、集体三等功等荣誉；主攻方向：骨髓增殖性肿瘤专病诊断和治疗、血液病流式细胞检测，负责血液病专病临床形态学、免疫学、分子生物、细胞遗传学综合诊断实验室。擅长骨髓增殖性肿瘤诊断和治疗；负责血液病流式免疫分型、恶性血液病疑难病例 MICM 综合诊断、急慢性白血病精确诊断和分型；CAR-T、造血干细胞移植等细胞治疗技术保障。

主持及合作主持国家自然基金等省部级以上基金 7 项, 共参与省部级以上基金 20 余项，合计 1300 万元，以第一或通讯发表 13 篇 SCI 期刊论文，总影响因子 46；已发表中文核心论文 30 篇；获得国家发明专利授权 3 项；2009 年度「上海市优秀博士学位论文」；2018 年上海市科学技术一等奖；获军队个人三等功 1 次、领衔团队获集体三等功 1 次。