作品描述：

分享自己研一以来做 WB 的结果和总结的一些经验

WB 的成长作为研一的萌新，WB 可是每周都会进行1-2 次的，但这个基础的实验也是让我极为头疼的实验，可称为“玄学”。以下将我这近一年的WB结果和经验分享出来，诸位献丑了。

1. 内参
WB 结果可靠不可靠，关键看内参。刚入学，WB 内参的结果是这样的

分析原因和解决方案：
（1） 配制的胶不合格。配制胶时用的仪器、试剂要干净无杂质；加入各种实际时要充分混匀，尤其最后的TEMED，要混匀胶，贴玻璃边角加入；凝固时避免碰撞、移动等。

（2） 电泳温度高，使胶变形。在电泳时可以减小电压或者用冰袋进行降温。
（3） 电泳电流不均一。换电泳槽，最好不要用最两边的孔。

（4） 内参选择不正确。参考文献选用合适的内参，对实验有影响的内参不可选用。
调整操作后，内参好看了一些，但有时还会不齐，这时候就要重新定量或者根据内参调整上样量了。

2. 目的
目的条带可是自己准备好几天的结果，也是问题出现最多的

（1） 膜上出现黑斑黑点。
原因分析与解决办法：
1) 封闭液未完全溶解。在配制封闭液时，要充分混匀，确保封闭粉完全溶解。
2) 洗涤不充分。在敷一抗前要充分洗涤去除封闭液；洗涤控制时间，未结合的杂质要清洗干净。

（2） 目标条带无信号
原因分析与解决办法：
1) 蛋白降解。蛋白在收取中要注意在冰上操作；提取或者保存时添加蛋白抑制剂；避免反复冻融。
2) 表达量过低。可以根据内参判断是否为蛋白问题；增加上样蛋白量；增加曝光时间。
3) 转膜错误。可根据内参来判断是否为转膜原因；选取适合目的分子量的转膜电压和时间；三明治结构未放反；选择合适的PVDF膜。4) 抗体错误。一抗特异性差，可根据文献选择合适公司的抗体；根据试剂商提供的说明书稀释抗体和使用抗体次数；二抗看清是兔抗还是鼠抗。
5) 洗膜过度。选择合适的洗膜时间。6) 曝光液失效。重新配置曝光液。

（3） 条带中有气泡
原因分析与解决办法：
1) 转膜失败。在转膜时要充分排干气泡；滤纸、海绵要铺平；转膜时注意降温，可在冰箱中电转。

2) 配胶不合格。见前。
3) 曝光错误。膜与曝光底板紧密贴合，无气泡；曝光液滴加均匀。

（4） 杂带过多
原因分析与解决办法：
1) 抗体特异性差。见前。
2) 磷酸化蛋白。
3) 封闭不彻底。选择合适的封闭液、封闭时间及封闭液浓度。

（5） 图片背景太深
原因分析及解决办法：
1) 洗膜不充分。见前
2) 抗体浓度过高。
3) 封闭时间或浓度不当。
4) 曝光液失效或配制比例错误。

（6） 哑铃型条带
原因分析及解决方法：
1) 胶配制不合格。见前。
2) 样本中有杂质。收取蛋白时注意周围环境，避免杂质进入；使用样品前离心。

现在，可以跑出一些好看的条带，但重要的是要有期望的趋势，这又考虑很多的因素，只能慢慢控制好每一步，重复实验啦。

以上就是我的 WB 成长之路，也是我这一年来的成长，与诸位共勉。

 Bio-Rad官方评论  ：你的经验太棒了，不送你上墙就是我的错了，😄