Western Blot，这个蛋白研究最常见的实验之一，具有步骤长，变量多，易做难精的特点。做一轮实验经常需要两天，还很容易由于方案设计或操作失误出现翻车，真是令人头秃。
想缩短实验周期还不降低数据质量，有可能吗？即刻体验赛默飞 iWestern 流程方案，不仅能让 Western Blot 从两天一次变一天两次，更能确保结果准确性和可重复性，达到高水平期刊的要求。
iWestern 流程一览
3 个多小时就能做完一轮 WB，条带图还很漂亮？是的！
来看看 iWestern 方案是如何为 WB 提效的？
Step 1 蛋白定量
想要把多个样品进行平行比较，测算凝胶上样量，蛋白定量必不可少。
BCA 法由于灵敏度高、线性范围宽，均一性和去垢剂兼容性更好，是很常用的定量方法，但 BCA 法的槽点是孵育时间太久了——37°C 下半小时或室温 2 小时。如果需要经常定量，这个时间成本会很高。
如何兼顾 BCA 法的「准」与 Bradford 法的「快」？
Pierce™ Gold BCA 快速蛋白定量试剂盒
• 节省时间-反应时间缩短至 5 分钟，室温孵育即可
• 高均一性-蛋白间差异显著低于染料结合方法
• 兼容性强-与多数离子和非离子型去污剂兼容
• 高线性度-BSA 的线性范围为 20 至 2000 µg/mL
Step 2 蛋白电泳
要说哪个环节麻烦又耗时，配胶说自己是第二，没人敢说第一！
随着实验工具的便捷化，蛋白预制胶已走进千万 Lab。不仅可节省大量配胶和等待的时间，还避免受到漏胶或不凝的折磨。当然，选择预制胶品牌还需考虑凝胶质量是否稳定，条带是否平直锐利。
用预制胶有哪些快乐，是配胶的你所无法体会的？
Invitrogen NuPAGE Bis-Tris 蛋白预制胶
• 跳过配胶，跑胶最短只需 35 分钟，让电泳环节快到飞起
• 中性 pH 体系，条带锐又直，避免蛋白修饰
• 严格质控，提高结果重复性
• 种类齐全，即有常用的小型胶，也有适合高通量电泳的中型胶
• 提供超值 NuPAGE 预制胶迎新套装*
* NuPAGE 预制胶迎新套装包含了开始电泳的所有必备产品-电泳槽, 预制胶, 缓冲液, 蛋白 Ladder；可选择中型胶和小型胶规格
此外，Invitrogen 蛋白预制胶还有一众小弟，帮你应对特殊蛋白样品的挑战。
• NativePAGE Bis-Tris 非变性胶—基于 BN-PAGE 技术，不挑 pI 值，去垢剂兼容型好
• NuPAGE Tris-乙酸胶—高效分离 40-500 kDa 的大蛋白
• Tricine 预制胶—专用于分离 2–20 kDa 的小蛋白和多肽
Step 3 转印
冰冷的水槽，漫长的等待，搭配你淡黄的长裙，蓬松的头发吗？NoNoNo！转印也需要中国速度。
Power Blotter 转印卡匣和基座两部分组成，每个人可拥有自己名字的卡匣，10 分钟排个队，喝杯咖啡提个神，转印完成。
相比动辄 1-2 小时的湿转，10 分钟内完成转印不香吗？
Power Blotter 半干式快速转印系统
• 快速-5-10 分钟将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜或 PVDF 膜
• 可靠-可为多种不同分子量蛋白质提供高转印效率
• 灵活- 可以使用 DIY 耗材，也可搭配配套耗材，除了转印 TA 还能 10 分钟快染
• 通量高- 标准卡匣一次可转 2 块标准膜，XL 卡匣（图片左侧）一次可转 4 块标准膜
Step 4 印迹孵育
如果你不赶时间，可以慢悠悠地室温封闭 1-2 小时。如果想在一天内完成 2 轮 WB，不妨换一种更高效的封闭方式。常用的脱脂奶粉和 BSA 封闭液还存在适用范围有局限性，而且无法长期保存的问题。
如何让封闭再快一点，S/N 再高一些？
StartingBlock™ 系列即用型封闭液
• 15 分钟内完成 PVDF/NC 膜的封闭
• 成分单一，不含生物素和血清蛋白，降低交叉反应
• 印迹剥离后无需重复封闭
• 高信噪比，背景干净
• 种类齐全, 可选含 PBST/TBST/PBS/TBS 配方
封闭完成后，接下来就是孵育抗体了。
内参蛋白，您选对了吗？
我们都知道，选择内参蛋白的时候，需要考虑目的蛋白的大小，一般目的蛋白与内参蛋白的大小要相差 5kD，这样它们才不会重叠。再者，不同的样本类型，内参蛋白表达可能也有差别。因此选对内参抗体尤为重要。
Invitrogen 可提供多种优质内参抗体，分子量蛋白范围广达 15-150KD，靶向不同的细胞组分，涉及多个样本类型和物种，是您 WB 检测的不二之选。
孵育好一抗和二抗，就到化学发光底物了。WB 高手都会搭配至少 2 种级别的底物，根据蛋白表达丰度和样品量的情况选用。日用款宜选灵敏度适中、性价比高的类型，用于常规 WB 检测，高敏款底物来解决有挑战的低丰度蛋白。对于新靶点的摸索，建议首选日用款底物，如果信号太弱，再换高灵敏度底物尝试。
底物五花八门，怎么搭配比较合理？
SuperSignal 系列化学发光底物
• SuperSignal Pico Plus 底物：信号持久，可多次曝光，提高重复性；高 fg 级灵敏度满足常见样品的检测需求，是日常 WB 的首选
• SuperSignal Atto 极敏底物：阿克级 (ag) 灵敏度，即使蛋白丰度极低或样品量极其有限，也可轻松获得明亮条带
Step 5 成像
膜上不是没有条带，而是缺乏发现它们的眼睛；
一张膜上想要同时获取多个条带的平行数据，怎么破？
想要一个免费软件，可以计算条带分子量，灰度值，做管家基因和总蛋白定量的那种…
借你一双慧眼和巧手吧，看清这条带之间的爱恨纠葛
iBright 智能成像系统
• 910 万冷却 CCD 相机：高灵敏度和宽动态范围有助于检测样品中的细微差异
• 五个荧光通道：在单个印迹中通过多通道功能采集多达 4 种蛋白质信号，所得实验结果更有意义和更具代表性
• 智能曝光技术：快速确定最佳曝光时间
• 简单操作界面：清晰的功能和特性布局，结合 12.1 英寸电容式触摸屏，带来流畅的成像体验
• 多种图像分析选项：使用仪器上的软件或电脑端 iBright 分析软件（可在桌面和基于云的版本中使用）直接在 iBright 上执行光密度测定，定量和归一化
Step 6 归一化
想分析和比较蛋白表达量，就需要进行定量 WB；想让定量 WB 结果可靠又线性，通过归一化修正非系统相关的误差必不可少。然而，基于管家蛋白的归一化很容易信号饱和，管家蛋白本身的表达还会受到处理条件、组织类型或细胞状态的影响，如何破？
不用内参做，还有更好的办法么？
No-Stain 免染型蛋白标记试剂
• 准确-总蛋白归一化新工具，不再依赖单一内参蛋白，符合主流期刊对定量 WB 的要求
• 灵活-可选择标记膜或凝胶，无需购买特定蛋白胶
• 易用-混匀后孵育 10 分钟即可完成操作，配合 iBright 系统更可轻松获取归一化数据
iWestern 流程，让你不用学好 PS，也能轻松拿到漂亮结果。
