iWestern 之旅:打开 WB 新世界的大门
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2020-09-30

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Western Blot,这个蛋白研究最常见的实验之一,具有步骤长,变量多,易做难精的特点。做一轮实验经常需要两天,还很容易由于方案设计或操作失误出现翻车,真是令人头秃。

想缩短实验周期还不降低数据质量,有可能吗?即刻体验赛默飞 iWestern 流程方案,不仅能让 Western Blot 从两天一次变一天两次,更能确保结果准确性和可重复性,达到高水平期刊的要求。

iWestern 流程一览
3 个多小时就能做完一轮 WB,条带图还很漂亮?是的!

 

来看看 iWestern 方案是如何为 WB 提效的?


Step 1 蛋白定量

想要把多个样品进行平行比较,测算凝胶上样量,蛋白定量必不可少。

BCA 法由于灵敏度高、线性范围宽,均一性和去垢剂兼容性更好,是很常用的定量方法,但 BCA 法的槽点是孵育时间太久了——37°C 下半小时或室温 2 小时。如果需要经常定量,这个时间成本会很高。

如何兼顾 BCA 法的「准」与 Bradford 法的「快」?

Pierce™ Gold BCA 快速蛋白定量试剂盒

• 节省时间-反应时间缩短至 5 分钟,室温孵育即可

• 高均一性-蛋白间差异显著低于染料结合方法

• 兼容性强-与多数离子和非离子型去污剂兼容

• 高线性度-BSA 的线性范围为 20 至 2000 µg/mL


Step 2 蛋白电泳

要说哪个环节麻烦又耗时,配胶说自己是第二,没人敢说第一!

随着实验工具的便捷化,蛋白预制胶已走进千万 Lab。不仅可节省大量配胶和等待的时间,还避免受到漏胶或不凝的折磨。当然,选择预制胶品牌还需考虑凝胶质量是否稳定,条带是否平直锐利。

用预制胶有哪些快乐,是配胶的你所无法体会的?

Invitrogen NuPAGE Bis-Tris 蛋白预制胶

• 跳过配胶,跑胶最短只需 35 分钟,让电泳环节快到飞起

• 中性 pH 体系,条带锐又直,避免蛋白修饰

• 严格质控,提高结果重复性

• 种类齐全,即有常用的小型胶,也有适合高通量电泳的中型胶

• 提供超值 NuPAGE 预制胶迎新套装*

* NuPAGE 预制胶迎新套装包含了开始电泳的所有必备产品-电泳槽, 预制胶, 缓冲液, 蛋白 Ladder;可选择中型胶和小型胶规格

此外,Invitrogen 蛋白预制胶还有一众小弟,帮你应对特殊蛋白样品的挑战。

• NativePAGE Bis-Tris 非变性胶—基于 BN-PAGE 技术,不挑 pI 值,去垢剂兼容型好

• NuPAGE Tris-乙酸胶—高效分离 40-500 kDa 的大蛋白

• Tricine 预制胶—专用于分离 2–20 kDa 的小蛋白和多肽


Step 3 转印

冰冷的水槽,漫长的等待,搭配你淡黄的长裙,蓬松的头发吗?NoNoNo!转印也需要中国速度。

Power Blotter 转印卡匣和基座两部分组成,每个人可拥有自己名字的卡匣,10 分钟排个队,喝杯咖啡提个神,转印完成。

相比动辄 1-2 小时的湿转,10 分钟内完成转印不香吗?

Power Blotter 半干式快速转印系统

• 快速-5-10 分钟将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜或 PVDF 膜

• 可靠-可为多种不同分子量蛋白质提供高转印效率

• 灵活- 可以使用 DIY 耗材,也可搭配配套耗材,除了转印 TA 还能 10 分钟快染

• 通量高- 标准卡匣一次可转 2 块标准膜,XL 卡匣(图片左侧)一次可转 4 块标准膜


Step 4 印迹孵育

如果你不赶时间,可以慢悠悠地室温封闭 1-2 小时。如果想在一天内完成 2 轮 WB,不妨换一种更高效的封闭方式。常用的脱脂奶粉和 BSA 封闭液还存在适用范围有局限性,而且无法长期保存的问题。

如何让封闭再快一点,S/N 再高一些?

StartingBlock™ 系列即用型封闭液

• 15 分钟内完成 PVDF/NC 膜的封闭

• 成分单一,不含生物素和血清蛋白,降低交叉反应

• 印迹剥离后无需重复封闭

• 高信噪比,背景干净

• 种类齐全, 可选含 PBST/TBST/PBS/TBS 配方

封闭完成后,接下来就是孵育抗体了。

内参蛋白,您选对了吗?

我们都知道,选择内参蛋白的时候,需要考虑目的蛋白的大小,一般目的蛋白与内参蛋白的大小要相差 5kD,这样它们才不会重叠。再者,不同的样本类型,内参蛋白表达可能也有差别。因此选对内参抗体尤为重要。

Invitrogen 可提供多种优质内参抗体,分子量蛋白范围广达 15-150KD,靶向不同的细胞组分,涉及多个样本类型和物种,是您 WB 检测的不二之选。

孵育好一抗和二抗,就到化学发光底物了。WB 高手都会搭配至少 2 种级别的底物,根据蛋白表达丰度和样品量的情况选用。日用款宜选灵敏度适中、性价比高的类型,用于常规 WB 检测,高敏款底物来解决有挑战的低丰度蛋白。对于新靶点的摸索,建议首选日用款底物,如果信号太弱,再换高灵敏度底物尝试。

底物五花八门,怎么搭配比较合理?

SuperSignal 系列化学发光底物

• SuperSignal Pico Plus 底物:信号持久,可多次曝光,提高重复性;高 fg 级灵敏度满足常见样品的检测需求,是日常 WB 的首选

• SuperSignal Atto 极敏底物:阿克级 (ag) 灵敏度,即使蛋白丰度极低或样品量极其有限,也可轻松获得明亮条带


Step 5 成像

膜上不是没有条带,而是缺乏发现它们的眼睛;

一张膜上想要同时获取多个条带的平行数据,怎么破?

想要一个免费软件,可以计算条带分子量,灰度值,做管家基因和总蛋白定量的那种…

借你一双慧眼和巧手吧,看清这条带之间的爱恨纠葛

iBright 智能成像系统

• 910 万冷却 CCD 相机:高灵敏度和宽动态范围有助于检测样品中的细微差异

• 五个荧光通道:在单个印迹中通过多通道功能采集多达 4 种蛋白质信号,所得实验结果更有意义和更具代表性

• 智能曝光技术:快速确定最佳曝光时间

• 简单操作界面:清晰的功能和特性布局,结合 12.1 英寸电容式触摸屏,带来流畅的成像体验

• 多种图像分析选项:使用仪器上的软件或电脑端 iBright 分析软件(可在桌面和基于云的版本中使用)直接在 iBright 上执行光密度测定,定量和归一化


Step 6 归一化

想分析和比较蛋白表达量,就需要进行定量 WB;想让定量 WB 结果可靠又线性,通过归一化修正非系统相关的误差必不可少。然而,基于管家蛋白的归一化很容易信号饱和,管家蛋白本身的表达还会受到处理条件、组织类型或细胞状态的影响,如何破?

不用内参做,还有更好的办法么?

No-Stain 免染型蛋白标记试剂

• 准确-总蛋白归一化新工具,不再依赖单一内参蛋白,符合主流期刊对定量 WB 的要求

• 灵活-可选择标记膜或凝胶,无需购买特定蛋白胶

• 易用-混匀后孵育 10 分钟即可完成操作,配合 iBright 系统更可轻松获取归一化数据

iWestern 流程,让你不用学好 PS,也能轻松拿到漂亮结果。

 

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