PCR 污染消除
Decontamination

PCR 实验室的首要任务是防止污染,上述篇章就讲述了我们应该如何预防污染,如果 PCR 实验室出现了气溶胶污染或者微生物污染,那么我们可以采取以下方法进行消除,可单独使用或结合使用:

3.1  消除气溶胶污染
3.1.1  UNG- 热启动 Taq 酶系统使用尿嘧啶 DNA- 糖苷酶(UNG),并用脱 氧尿苷三磷酸(dUTP)代替脱氧胸腺三磷酸(dTTP),用于防止 dUTP 标记的 PCR 产物。
尿嘧啶 DNA- 糖苷酶(UNG)的作用原理是:选择性水解断裂含有 dU 的双链或单链 DNA 中的尿嘧啶糖苷键,形成的有缺失碱基的 DNA 链,在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂,从而被消除。最佳活性温度为 50°C,95°C 即可灭活。高品质的 UNG 酶可以消除高达 108 的 U-DNA 产物,和热启动 Taq 酶一同用于建立含有 UNG/dUTP 防污染体系的热启动 PCR 反应系统。

 

3.1.2 紫外照射 (UV)
对于所有的核酸污染均有效,但是不能消除所有污染,只能将污染降低几个数量级,而且当 DNA 片段小于 300bp 时,消除污染的效果很差(Sarkar and Sommer 1990, 1991),适合进行大面积实验台及实验室环境的定期消除方法,也可以用于工具、耗材和样品架的污染消除。

紫外线照射后 DNA,发现有几个变化,其中最明显的变化是同一链上的两个邻接嘧啶核苷酸的共价联结,形成嘧啶二聚体 (thymine dimer,T T ),此外还有胞嘧啶二聚体腺(CC)以及胸嘧啶和胞嘧啶二聚体 (CT)。这些嘧啶二聚体使双螺的两链的键减弱,使 DNA 结构局部变形,严重影响照射 后 DNA 的复制和转录。含有嘧啶二聚体的 DNA 的链不能作为 DNA 复制的样板,新合 成的链在二聚体的对面和两旁留下了缺口 。

由于紫外照射的距离和能量对去除污染的效果非常关键,工作台面可在工作完成后使用可移动紫外灯(254 nm),调至实验台上 60-90 cm 内照射(《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》);实验室定期进行紫外照射可降低污染几率,安装要求: 每 20m2 安装一支 40W 的紫外灯(254 nm),距离地面距离不宜超过 2.0 m±0.1 m(GBT19495.2-2004),各个实验室需要根据实际情况开展。


3.1.3  化学试剂方法
可选择次氯酸钠 (5-10%)、 甘氨酸—盐酸缓冲液、 1 mol/L 盐酸,进行台面、操作工具、样品架、塑料及玻璃器皿的清洁。
·  次氯酸钠(5-10%)
氯属于快速作用的氧化剂,是一种可广泛应用的广谱化学杀菌剂。它一般作为漂白剂销售,使用时可以用水稀释成各种不同的有效氯浓度。

·  甘氨酸—盐酸缓冲液 /1 mol/L 盐酸
10× 甘氨酸—盐酸缓冲液配制方法:30.6 g 氯化钠(NaCl),39.2g 甘氨酸(Glycine), 523 mL 水(H2O),溶解后加入 1N 盐酸(HCl)至 1000 mL,使用时请稀释到 1×。稀酸可以使得 DNA 脱嘌呤,从而失去作为 PCR 模板 DNA 的可能。


3.2  去除微生物污染(以下方式可单独使用或结合使用)
3.2.1  使用 60% 异丙醇 / 70-75% 乙醇(C2H5OH)和异丙醇[(CH3) 2CHOH]具有相似的灭菌特性。它们对于繁殖的细菌、真菌和含脂病毒具有活性,但不能灭活孢子,而对非含脂病毒的作用则不确定。作用机理是醇类分子进入到蛋白质分子的肽链环节蛋白质变性,并能够渗透到细菌体内破坏细胞壁和微生物酶系统。

醇类溶液的主要优点是处理后物品不会留下任何残留物。适用于工具及样品架的微生物取出和台面清洁。

3.2.2 紫外照射(UV)
紫外照射灭菌原理主要是破坏微生物的染色体(3.4.1.2),主要用于台面、工具、耗材、样品架的表面灭菌,适合于大面积区域: PCR 工作台和实验室的灭菌,配合 70-75% 乙醇可提高灭菌效果。

3.2.3 高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌是生物学实验室对实验材料灭菌最有效和最可靠的方法,适用于工具,溶液,耗材的灭菌方式。Eppendorf 移液器可进行高压灭菌(依照不同型号,请参照厂家说明书)。