PCR 污染监控
PCR Control
质控严格的实验室,要时刻对污染进行监控,发现产生污染的原因,以便采取措施,防止和消除污染。为了保证 PCR 结果真实可靠, 在进行 PCR 过程中,我们需要设置不同的对照实验对 PCR 整个过程进行质控。

2.1 阳性对照 (positive DNA target control) 
用于确定 PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志,用于监测试剂质量,在体系构建阶段引入,帮助我们排除假阴性结果。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高(100 个拷贝以下)。
如果阳性对照结果是阴性,可以确定 PCR 试剂失效,最大可能是 Taq 酶失活。


2.2 阳性内对照 (internal positive control) 
帮助我们排除由于 PCR 抑制条件导致的假 阴性结果的对照,亦可称做 PCR 抑制剂对照,通常使用外源 DNA,且在竞争 PCR 中具有扩增优势。
在 DNA 提取和 PCR 准备步骤引入阳性内对照,同一 PCR 反应管中即包含 IPC DNA 和引物,又包含样品 DNA 和引物,当存在 PCR 抑制剂或 DNA 样品中蛋白质去除不彻底,将只有 IPC PCR 产物扩增,那么需要对 DNA 样品进行进一步纯化。


2.3 空白对照(no template control) 
是指用水代替模板 DNA 进行 PCR 反应,需要在每次实验中进行。空白对照的使用能够帮助我们确定 PCR 反应中所使用的溶液和试剂是否存在污染,帮助我们排除假阳性结果。
如果空白对照出现阳性结果,则表示反应过程中存在交叉污染或者实验室空气存在污染,与环境对照结果结合判断污染源,如环境对照呈现阴性结果,需要尽量更换使用的溶液和试剂。


2.4 环境对照(开管对照,environment control/open control) 
用于确定实验空气中是否存在气溶胶污染, 在 PCR 实验从试剂准备、样品制备到核酸制备和 PCR 扩增准备四个阶段均需设置,该对照是在管中加入不含核酸的适量体积的水,在样品测试整个过程中均敞开与空气接触(GBT19495.1-2004),与样品同时进行 PCR 反应。
如果结果显示阳性,那么提示某个房间或者分区已经出现气溶胶污染。


2.5 外源模板阴性对照(阴性目标 DNA 对照 / 阴性对照,negative DNA target control) 
用于验证在无目的模板 DNA 的条件下,是否有假阳性结果产生,同时可以验证引物的特异性。适用于进行多个模板扩增的实验室、 临床诊断实验室或者从事 PCR 诊断试剂盒研发的实验室,在 PCR 体系构建阶段引入,正常情况下,无关模板无法被扩增。
如果外源模板阴性对照显示阳性结果,那么需要排除目的模板 DNA 的污染情况;如果无模板 DNA 污染,那么说明引物的特异性差,需要重新设计引物。
根据 PCR 实验目的不同,还可设置核酸提取空白对照对提取试剂进行质控;PCR 抑制剂对照对 DNA 中是否含有 PCR 抑制剂进行质控;弱阳性目标序列对照对方法检测低限进行质控。